胰岛淀粉样多肽（IAPP）的积聚和淀粉样蛋白形成与人类胰岛β细胞功能障碍和细胞死亡相关，并可能促进干细胞衍生的胰岛（SC-islet）移植后的移植物衰竭。BRICHOS结构域是从Bri2蛋白中裂解出的分泌肽，具有分子伴侣活性，并已被证明能抑制脑中淀粉样β肽和人类胰岛中IAPP的纤维形成。本研究旨在评估体外SC-islet中的淀粉样蛋白形成，并评估Bri2 BRICHOS对淀粉样蛋白形成和β细胞功能的作用。
以下为本文主要实验流程：以人SC-胰岛细胞为体外模型，探讨淀粉样蛋白的加速形成，并通过腺病毒转导的过表达研究Bri2 BRICHOS的作用。SC-胰岛细胞在正常葡萄糖条件或代谢应激样条件下培养。随后，通过淀粉样蛋白特异性配体五聚体甲酰噻吩乙酸染色和透射电子显微镜观察来确定淀粉样蛋白的形成。通过静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胰岛素含量来评估β细胞功能。通过免疫染色和共聚焦显微镜观察来评估相关蛋白的存在。通过qRT-PCR来评估目标基因的mRNA表达谱。
为确保IAPP在分化后期的表达和分布，选取了第7阶段（第6周）的SC-胰岛并进行了检查。免疫染色证实了SC-胰岛中IAPP的表达，且该肽与胰岛素染色的β细胞共定位（下图a）。胰高血糖素阳性的α细胞中未检测到IAPP反应。SC-胰岛和人胰岛中IAPP的基因表达无差异（下图b）。然而，SC-胰岛中INS基因的表达仅达到人胰岛中检测水平的50%（下图c）。相比之下，SC-胰岛中GCG的表达是人胰岛中检测水平的两倍（下图d）。这些基因的mRNA表达与SC-胰岛与人胰岛比较所得的RNA测序结果一致。SC-胰岛和人胰岛中胰岛素和胰高血糖素基因表达的差异可能取决于表达水平，或表明分化的SC-胰岛与分离的人胰岛中胰岛素分泌β细胞和胰高血糖素分泌α细胞的比例不同。
构建可操控的IAPP淀粉样蛋白
形成的体外SC胰岛模型
在代谢应激下，SC胰岛中会触发淀粉样蛋白形成。IAPP和胰岛素的表达是并行调节的，而长时间的β细胞应激（如高浓度葡萄糖）会导致胰岛素和IAPP合成同时增加，这可能导致人IAPP转基因小鼠分离胰岛中淀粉样蛋白的形成。在本研究中，使用淀粉样蛋白特异性配体pFTAA进行淀粉样蛋白检测。在20 mmol/l葡萄糖中培养14天的人胰岛，其淀粉样蛋白含量几乎是暴露于5.5 mmol/l葡萄糖的人胰岛中检测到的淀粉样蛋白含量的两倍（下图a，b）。当人胰岛在1.5 mmol/l棕榈酸钠或20 mmol/l葡萄糖与1.5 mmol/l棕榈酸钠的组合中培养时，与在5.5 mmol/l葡萄糖中培养的胰岛相比，仅观察到淀粉样蛋白形成略有增加（下图a，b）。有趣的是，与在5.5 mmol/l葡萄糖中培养的SC胰岛中形成的淀粉样蛋白量相比，所有三种代谢应激条件（20 mmol/l葡萄糖、1.5 mmol/l棕榈酸钠或20 mmol/l葡萄糖与1.5 mmol/l棕榈酸钠的组合）均能显著触发SC胰岛中淀粉样蛋白的形成（图2c，d）。此外，对代谢应激培养条件下的SC胰岛进行电子显微镜检查，发现了淀粉样蛋白的存在（下图e）。另外，在5.5 mmol/l葡萄糖中培养的SC胰岛中鉴定出的致密核心胰岛素颗粒，在代谢应激条件下培养的SC胰岛中有所减少（下图e）。至此成功建立了可操控的IAPP淀粉样蛋白形成的体外SC胰岛模型，该模型可用于研究可预防淀粉样蛋白形成的潜在靶点。由于高水平的葡萄糖会刺激人胰岛和SC胰岛中淀粉样蛋白的形成，因此在后续实验中仅使用20 mmol/l葡萄糖作为代谢应激条件。
将Bri2-BRICHOS结构域的
外源性表达已引入SC胰岛
ITM2B在人类胰岛中高度表达；其表达与INS基因表达呈正相关，与IAPP基因表达呈负相关。用抗Bri2抗体进行免疫标记显示，在5.5 mmol/l葡萄糖中培养的SC胰岛中，Bri2的内源性表达较低，在20 mmol/l糖中培养7天后，SC胰岛中Bri2的表达较高（下图a，b）。在20 mmol/l葡萄糖中培养SC胰岛7天，增加了内源性ITM2B和ADAM10的mRNA表达水平，无论病毒滴度如何，这种增加都不受Ad-BRICHOS结构域外源转导的影响（下图d，e）。在正常葡萄糖条件下（5.5 mmol/l），低滴度和高滴度的Ad-BRICHOS均不影响ITM2B或ADAM10的基因表达。这一观察表明，在代谢应激（如高水平葡萄糖）下，β细胞内源性Bri2表达上调，同时ADAM10表达增加，ADAM10促进蛋白水解切割并释放BRICHOS结构域。Bri2-BRICHOS结构域在SC胰岛中的过表达是通过使用腺病毒进行病毒转导实现的。低病毒滴度和高病毒滴度的病毒转导效率分别为13%至69%和31%至67%。正如预期的那样，Ad-BRICHOS转导的SC胰岛表现出强烈的信号，证实了外源性Bri2-BRICHOS结构域的产生（下图a）。还对转导的SC胰岛进行了胰岛素和胰高血糖素的免疫标记，Bri2-BRICHOS结构域信号存在于胰岛素阳性β细胞和胰高葡萄糖素阳性α细胞中。用于Ad-BRICHOS转导的病毒滴度不影响检测到的Bri2阳性细胞的数量（下图a，c）。因此，Bri2-BRICHOS结构域的外源性表达已成功引入SC胰岛。
验证Bri2-BRICHOS结构域
可以部分保护SC胰岛的β细胞功能
在20 mmol/l葡萄糖中培养7天后，SC胰岛中诱导的类同体形成因Bri2-BRICHOS结构域的过表达而减少，无论Ad-BRICHOS的滴度是低还是高（下图a，b）。然而，长期高糖培养下SC胰岛细胞内胰岛素含量的降低可以通过低但不高的Ad-BRICHOS转导滴度来恢复（下图c）。此外，Bri2-BRICHOS结构域的过表达和低滴度的Ad-BRICHOS病毒转导对β细胞功能具有类似的保护作用，这可以通过静态GSIS的刺激指数来评估（下图d，e）。
与用20 mmol/l葡萄糖处理的SC胰岛相比，病毒Ad-BRICHOS在SC胰岛中的过表达不会影响线粒体呼吸（基础呼吸、ATP偶联呼吸和最大呼吸）或糖酵解（基础ECAR）（下图a-g）。用低滴度Ad-BRICHOS病毒转导的SC胰岛显示出与对照SC胰岛相似的OCR和ECAR谱（下图a-g）。
SC胰岛暴露于20 mmol/l葡萄糖后，β细胞死亡略有增加（p=0.5-0.8），但Annexin VHigh染色显示早期凋亡略有减少，但Bri2 BRICHOS过表达没有显著变化（下图a，b）。这表明，当用20 mmol/l葡萄糖处理时，SC胰岛中的β细胞从早期凋亡到完全凋亡的进展更快。基于这些发现证实，在高水平葡萄糖下长期培养的体外代谢应激会引发SC胰岛淀粉样蛋白的形成，损害β细胞功能。通过适当过表达Bri2-BRICHOS结构域抑制SC胰岛中淀粉样蛋白的形成，可以部分保护SC胰岛的β细胞功能免受长期暴露于高水平葡萄糖引起的代谢应激。
综上所述，研究结果表明，分子伴侣Bri2与胰岛β细胞中的胰岛淀粉样蛋白（IAPP）和胰岛素共定位。Bri2中的BRICHOS结构域具有折叠辅助作用，而BRICHOS结构域的病毒过表达可防止细胞毒性IAPP淀粉样蛋白的形成，并改善暴露于代谢应激的SC-胰岛β细胞的功能。对SC-胰岛功能的综合分析排除了β细胞损伤是淀粉样蛋白减少的原因，但支持了对IAPP淀粉样蛋白的保护作用。
在该项研究中，对于SC-胰岛细胞凋亡的流式检测使用了来自Cytek®Northern Lights™全光谱流式细胞仪，该仪器优秀的全光谱性能帮助科学家们以更便捷的实验流程获得更科学精准的数据。
Cen, J., Ivis, A., Vasylovska, S., Adjieva, K., Lindsay, R. S., Westermark, G. T., & Lau, J. (2025). Bri2 BRICHOS domain inhibits IAPP amyloid formation and improves beta cell function in stem cell‑derived islets under metabolic stress. Diabetologia, 69, 436‑450.
